自2020年10月(yuè)(yuè)上(shàng)海快(kuài)靈發布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”（下(xià)稱高敏試劑盒）以來，其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩定性迅速被廣大豬場實驗室認可。随着熒光PCR相關技術的普及以及用戶群體的增大，部分(fēn)之前未被重視的問題也(yě)逐漸顯露出來。本篇我們探討(tǎo)下(xià)各廠家都諱莫如(rú)深的一(yī)個點——“假陽”問題，以及相應的解決方案。

“假陽”問題，事(shì)實上(shàng)在熒光PCR領域并不少見，而造成假陽産生(shēng)的原因也(yě)是紛繁複雜：如(rú)操作(zuò)不當污染、環境氣溶膠污染或者試劑生(shēng)産過程污染等。本文所要探討(tǎo)的“假陽”，主要指因試劑特異性導緻的假陽，換句話說，即文中所提的“假陽”，與操作(zuò)者、儀器(qì)、環境均無關，隻與試劑盒内的試劑有關。那麽試劑盒中到底什(shén)麽與“假陽”相關呢(ne)？縱觀商(shāng)業化(huà)的非瘟病毒PCR檢測試劑盒，其中都會提及一(yī)個重要參數——特異性。

何爲特異性呢(ne)？在PCR擴增過程中，如(rú)果我們要擴增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上(shàng)不止出現了(le)一(yī)次，或者樣品中混有的其他物種、細胞或病毒的DNA中含有類似的DNA片段，則可能(néng)會将其他片段擴增出來，那最後儀器(qì)顯示出來的陽性結果就(jiù)不一(yī)定是非瘟病毒DNA造成的，于是陽性結果也(yě)就(jiù)變成了(le)假陽。因此，通俗來說，特異性反應的是試劑盒能(néng)擴增出特定DNA片段的性能(néng)，特異性越低(dī)，則試劑盒擴增其他片段的概率就(jiù)越大，即“假陽”幾率更大。
   市(shì)售的衆多非瘟病毒PCR檢測試劑盒中，絕大多數廠商(shāng)在宣傳其試劑盒特異性時均會标注＞99%，最低(dī)也(yě)不會低(dī)于98%，快(kuài)靈的高敏試劑盒也(yě)是如(rú)此，特異性可達到99.9%，屬實是已經做到了(le)極限，即使PCR技術發展至今，因爲模闆DNA的不确定，依然無法保證100%的特異性。也(yě)正因此，特異性，也(yě)就(jiù)是假陽的問題是被大家忽視了(le)。

在服務客戶的過程中，我們發現很多客戶在進行非瘟病毒檢測遇到極弱樣本或疑似樣本時，對于陽性場，往往遵循的是“甯殺錯，不放(fàng)過”，而對于陰性場，往往帶來心理(lǐ)的恐慌，需要确認到底是不是陽性。的确，随着非瘟一(yī)波波的襲來，各檢測單位的工作(zuò)量都史無前例的倍增，再重新(xīn)來一(yī)遍的全面複核，顯然是對人(rén)力和成本的巨大考驗。面對這樣的大環境，快(kuài)靈人(rén)陷入了(le)沉思。

“我們爲什(shén)麽要甯殺錯？”

“當真沒有辦法消除假陽麽？”

帶着這樣的問題，我們開始了(le)新(xīn)的一(yī)輪又一(yī)輪的嘗試：提升試劑盒的靈敏度、将特異性由99%提升至99.9%……或許，我們可以把眼界放(fàng)寬，不局限于單純的擴增？

于是，高敏試劑盒上(shàng)市(shì)半年後，我們在高敏試劑盒基礎之上(shàng)研發出其“升級版”——快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）。

快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版），其性能(néng)參數與高敏試劑盒一(yī)緻，我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩定性、特異性處在行業頂尖水平，确保客戶可以第一(yī)時間檢測出陽性樣本。包括其操作(zuò)、擴增階段也(yě)與高敏試劑盒别無二緻，至此，我們可以把快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）等同于高敏試劑盒。詳見表1：

表1：高敏試劑盒與假陽确認試劑盒基本性能(néng)參數對比

但(dàn)，重點來了(le)！快(kuài)靈是怎麽做到的？快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）突破性地使用了(le)一(yī)個新(xīn)的反應程序——熔解曲線。熔解曲線能(néng)鑒别不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一(yī)個DNA片段中僅相差一(yī)個堿基，都能(néng)導緻Tm值變動。依靠Tm值的判定就(jiù)可以确認之前擴增陽性的非瘟樣本是否爲真的非瘟陽性，以此達到鑒别假陽，消除客戶疑慮的目的。

圖1：擴增曲線Ct.值判讀陰陽        圖2：熔解曲線檢測疑似/弱陽樣本，排除假陽

非瘟新(xīn)形勢下(xià)，除了(le)要求試劑盒更早的檢測出陽性，更需要真正“精準”檢測。快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）除了(le)超高的靈敏度、特異性，更是“自帶”熔解曲線，讓假陽無處可藏，讓弱陽“站(zhàn)得住腳”，真正做到打消客戶疑慮，真正做到“不殺錯、不放(fàng)過”。